Sanger Sequencing چیست؟
Sanger Sequencing یا توالییابی سنگر یکی از قدیمیترین و معتبرترین روشهای تعیین توالی DNA است که در سال ۱۹۷۷ توسط فردریک سنگر (Frederick Sanger) معرفی شد. اگرچه امروزه فناوری NGS (Next Generation Sequencing) امکان بررسی میلیونها قطعه DNA را بهطور همزمان فراهم کرده است، اما توالییابی سنگر همچنان بهعنوان استاندارد طلایی (Gold Standard) برای تأیید بسیاری از تغییرات ژنتیکی، بررسی ژنهای کوچک و کنترل کیفیت نتایج NGS در آزمایشگاههای ژنتیک و تشخیص پزشکی استفاده میشود.
Sanger Sequencing چیست؟
نحوه انجام، کاربردها و تفاوت توالییابی سنگر با NGS
- Sanger Sequencing روشی برای تعیین توالی دقیق DNA است.
- این روش بر پایه استفاده از نوکلئوتیدهای خاتمهدهنده یا ddNTP عمل میکند.
- برای بررسی ژنهای کوچک، تأیید نتایج NGS و شناسایی جهشهای نقطهای کاربرد دارد.
- نسبت به NGS ظرفیت کمتری دارد، اما برای قطعات محدود DNA دقت بسیار بالایی ارائه میدهد.
Sanger Sequencing چیست؟
Sanger Sequencing که با نام Chain Termination Method نیز شناخته میشود، روشی برای تعیین ترتیب بازهای DNA شامل A، T، C و G است. در این روش، هنگام تکثیر DNA از نوکلئوتیدهای ویژهای به نام Dideoxynucleotides یا ddNTP استفاده میشود که پس از اتصال، ادامه سنتز DNA را متوقف میکنند.
در پایان واکنش، مجموعهای از قطعات DNA با طولهای مختلف ایجاد میشود. این قطعات توسط دستگاه Capillary Electrophoresis از یکدیگر جدا شده و ترتیب بازها بهصورت یک کروماتوگرام رنگی نمایش داده میشود.
Sanger Sequencing چگونه کار میکند؟
ابتدا قطعه DNA موردنظر با استفاده از PCR تکثیر میشود. سپس محصول PCR همراه با پرایمر، DNA Polymerase، dNTPها و مقدار کمی ddNTP فلورسنت وارد واکنش توالییابی میشود.
هر زمان که یک ddNTP وارد رشته در حال سنتز شود، فرآیند تکثیر متوقف میشود. در نتیجه مجموعهای از قطعات با طولهای متفاوت تولید میشود. این قطعات در دستگاه الکتروفورز مویینه از هم جدا شده و آشکارساز فلورسنت، ترتیب دقیق بازهای DNA را ثبت میکند.
مراحل انجام Sanger Sequencing
اجزای اصلی سیستم Sanger Sequencing
دستگاه Sanger Sequencing چیست؟
دستگاه توالییابی سنگر معمولاً یک سیستم Capillary Electrophoresis است که قطعات DNA را بر اساس اندازه از هم جدا کرده و سیگنال فلورسنت هر باز را ثبت میکند.
خروجی دستگاه بهصورت Chromatogram نمایش داده میشود و کارشناس میتواند کیفیت خوانش و وجود جهشها را بررسی کند.
کاربردهای Sanger Sequencing
- تشخیص بیماریهای تکژنی
- بررسی جهشهای شناختهشده
- تأیید یافتههای NGS
- بررسی جهشهای محدود در ژنهای خاص
- تأیید برخی واریانتهای توموری
- بررسی کلونهای ژنی
- تأیید ساخت پلاسمید
- کنترل کیفیت محصولات PCR
- شناسایی برخی عوامل عفونی
- مطالعات فیلوژنتیک
- تعیین توالی ژنهای هدف
تفاوت Sanger Sequencing و NGS
| ویژگی | Sanger Sequencing | NGS |
|---|---|---|
| تعداد قطعات قابل بررسی | یک قطعه در هر واکنش | میلیونها قطعه بهصورت همزمان |
| سرعت | کمتر | بسیار بالا |
| هزینه برای تعداد کم نمونه | پایینتر | معمولاً بالاتر |
| هزینه برای پروژههای بزرگ | بالا | مقرونبهصرفهتر |
| تحلیل داده | سادهتر | پیچیده و نیازمند بیوانفورماتیک |
| کاربرد اصلی | ژنهای محدود و تأیید نتایج | پنلهای ژنی، WES، WGS و RNA-Seq |
مزایا و محدودیتهای Sanger Sequencing
- دقت بسیار بالا
- تکرارپذیری مناسب
- تحلیل آسانتر دادهها
- استاندارد طلایی برای تأیید واریانتها
- ظرفیت پایین
- زمان بیشتر برای پروژههای بزرگ
- مناسب نبودن برای بررسی تعداد زیاد ژن
- حساسیت کمتر در شناسایی برخی واریانتهای با فراوانی پایین
عوامل مؤثر بر کیفیت نتایج
کاربرد Sanger Sequencing در آزمایشگاههای مختلف
| نوع آزمایشگاه | کاربرد |
|---|---|
| ژنتیک پزشکی | تشخیص بیماریهای تکژنی و تأیید واریانتها |
| سرطان | بررسی جهشهای هدف |
| تحقیقاتی | کلونینگ، پلاسمید و مطالعات ژنی |
| میکروبشناسی | شناسایی برخی میکروارگانیسمها |
| دانشگاهی | آموزش و پروژههای پژوهشی |
وکتور چگونه میتواند در راهاندازی آزمایشگاه Sanger Sequencing کمک کند؟
راهاندازی یک بخش توالییابی سنگر علاوه بر دستگاه اصلی، به تجهیزات و مواد مصرفی متعددی نیاز دارد:
اگرچه بسیاری تصور میکنند NGS جایگزین کامل Sanger Sequencing شده است، اما در عمل چنین نیست. در بسیاری از آزمایشگاههای تشخیص پزشکی، یافتههای مهم NGS، بهویژه واریانتهایی که قرار است مبنای تصمیمگیری بالینی قرار گیرند، هنوز با توالییابی سنگر تأیید میشوند.
همچنین برای بررسی یک ژن یا یک ناحیه کوچک، Sanger معمولاً سریعتر، سادهتر و از نظر اقتصادی مقرونبهصرفهتر از اجرای یک آزمایش NGS کامل است.
برندهای مطرح تجهیزات و مواد Sanger Sequencing
- Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific)
- Beckman Coulter
- QIAGEN در برخی سامانههای مرتبط
- Hitachi در برخی مدلهای قدیمی
- Applied Biosystems BigDye Terminator
- Thermo Fisher Scientific
- Promega
- QIAGEN
- New England Biolabs (NEB)
سؤالات متداول
منابع
- Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences
- Brown TA. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction
- Rehm HL, et al. ACMG Technical Standards for Clinical DNA Sequencing
- Thermo Fisher Scientific. Applied Biosystems BigDye Terminator Cycle Sequencing Chemistry Guide
- Molecular Diagnostics: Fundamentals, Methods and Clinical Applications